Родился в дворянской семье, где получил начальное образование. Учился в Главном инженерном училище Петербурга, после окончания которого в 1848 проходил военную службу в Киеве. В 1850 вышел в отставку. В 1851 г. поступил вольнослушателем в Московский университет на медицинский факультет и с отличием окончил его в 1856 г. «в степени лекаря с отличием с предоставлением... права по защищении диссертации получить диплом на степень доктора медицины». Затем в течение трех с половиной лет Сеченов учился в Германии, занимался не только биологическими дисциплинами, но также физикой и аналитической химией. За границей зародилась тесная дружба Сеченова с С. П. Боткиным, Д. И. Менделеевым, А. П. Бородиным, художником А. Ивановым.
В начале 1860 г. Сеченов приехал в Петербург, защитил диссертацию на степень доктора медицинских наук. Он начал читать лекции в Медико-хирургической академии: в марте - курс «животного магнетизма», а с осени - полный курс физиологии. Сеченовская лаборатория стала в те годы центром исследований в области не только физиологии, но и токсикологии, фармакологии, клинической медицины. В 1870 г. Сеченов вышел в отставку и был избран профессором на кафедру физиологии в Новороссийский университет в Одессе. С 1876 по 1889 г. он занимал кафедру физиологии в Петербургском университете. С 1876 по 1901 г. преподавал в Московском университете сначала в качестве доцента, а с 1891 г. - в качестве профессора.
Много сил и времени отдавал Сеченов развитию женского образования. Под его руководством были проведены первые психофизиологические исследования, выполненные русскими женщинами. Сеченов участвовал в организации и работе Высших женских курсов в столице, преподавал на женских курсах при Обществе воспитательниц и учительниц в Москве.
Еще в «Тезах», предварявших докторскую диссертацию, Сеченов выдвинул положение о своеобразии рефлексов, центры которых лежат в головном мозге, и ряд идей, способствовавших последующему изучению им головного мозга. В 1862 г. в парижской лаборатории К. Бернара Сеченов экспериментально проверил гипотезу о влиянии центров головного мозга на двигательную активность (феномен центрального торможения, описанный им в 1863 г., был назван «сеченовским торможением»). Вернувшись в Россию в мае 1863 г., он по предложению Н. А. Некрасова написал для «Современника» статью под названием «Попытка ввести физиологические основы в психические процессы». Цензура наложила запрет на публикацию, усмотрев предосудительность в названии и «пропаганду материализма» в тексте. В том же году эта работа под названием «Рефлексы головного мозга» была напечатана в «Медицинском вестнике», а в 1866 г. вышла отдельным изданием. По выражению И. П. Павлова, это была «поистине для того времени чрезвычайная попытка... представить себе наш субъективный мир чисто физиологически». С этой работы началась эра объективной психологии.
В 1890-е годы Сеченов обращается к проблемам психофизиологии и теории познания. Курс лекций, читанный им в Московском университете, лег в основу «Физиологии нервных центров» (1891). В этой работе ученый анализировал весь спектр различных нервных явлений, от бессознательных реакций у животных до высших форм восприятия у человека. Важным направлением его научной деятельности стали также работы по вопросам физиологии газообмена, дыхательной функции крови, составу легочного воздуха. Этому отчасти способствовали и некоторые житейские обстоятельства: приобретя репутацию вольнодумного профессора и покинув кафедру в МХА, Сеченов некоторое время находился без работы, и его старый друг, Д. И. Менделеев, предложил поработать у себя в лаборатории. Сеченов принял предложение и занялся химией растворов. Ученик и друг Сеченова К. А. Тимирязев писал: «Едва ли какой из современных ему физиологов... обладал таким широким охватом в сфере своих собственных исследований, начиная с чисто физических исследований в области растворения газов и кончая исследованием в области нервной физиологии и строго научной психологии... Если прибавить к этому блестящую, замечательно простую, ясную форму, в которую он облекал свои мысли, то станет понятно то широкое влияние, которое он оказал на русскую науку, на русскую мысль даже далеко за пределами своей аудитории и своей специальности». В числе его учеников были также Н. Е. Введенский, И. П. Павлов, И. Р. Тарханов и др.